犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3（NF）(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体Lipofectamine^TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。     

虎源H5N1亚型高致病性禽流感病毒人工感染家猫的病理学研究

经SPF鸡胚增殖的虎源高致病性禽流感病毒A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)株,其对MDCK细胞的TCID50为10-7.36/0.05 mL,经气管接种途径人工感染家猫,对感染致死的家猫和对照组家猫心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器进行组织病理学观察和免疫组织化学染色,同时采集咽拭子和各脏器乳剂上清液进行RT-PCR检测,对耐过家猫与对照组家猫进行HI抗体测定。结果表明:剖检感染的死亡家猫以肺脏的损害最为明显,肺叶上有大片暗红色实变灶,呈多病灶融合性肺损伤。组织学光镜观察,病毒对家猫的损害主要见于肺脏,呈融合性炎性病变,浸润的主要为单核细胞,肺泡腔内可见较多量巨噬细胞浸润及少量蛋白样浆液渗出。免疫组织化学染色发现在支气管上皮细胞、少数肺泡上皮细胞和单核细胞胞浆中可见到该病毒的抗原阳性染色颗粒。RT-PCR检测结果在咽拭子以及肺、肾、心、脑组织中均扩出与理论值一致的464bp核酸条带,耐过家猫血清H5N1亚型流感病毒HI抗体效价为1∶32。     

建立适用于旋毛虫抗肿瘤相关基因筛选的动物模型

目的为利用抑制消减杂交（SSH）法筛选旋毛虫抗肿瘤相关基因,建立理想的动物模型获取可靠的实验样本。方法Balb／c小鼠随机分为检测组（Tester）和驱动组（Driver）,Tester为经口服感染旋毛虫250条、400条和550条组,Driver为不接种组,在感染后11d,两组同时在皮下分别接种SP^2/0细胞2×10^6个,只,检测组和驱动组小鼠荷瘤后,于20d后处死,采集两组肿瘤组织和脾脏组织,用天平称量肿瘤块的重量,游标卡尺测量肿瘤块3个互相垂直直径进行体积比较;为了检测两组小鼠免疫情况,又采用流式细胞术检测体内T淋巴细胞的动态变化,以便评估所需样本的可靠性。结果将肿瘤组织与正常组织分离后,经统计分析比较两组肿瘤块重量和体积大小的差异均极为显著（P〈0．01）通过检测T淋巴细胞亚类,FACS共检测1×10^5个细胞,分别得到脾细胞中CD3^＋、CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞的数量,感染组小鼠机体的CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋和CD4^＋／CD8^＋显著增高,在接种不同剂量的旋毛虫后荷瘤,小鼠脾脏特异的T淋巴细胞亚类：CD3^＋差异显著（P〈0．05）;CD4^＋差异显著（P〈0．05）;CD8^＋差异显著（P〈0．05）;CD4^＋／CD8^＋差异显著（P〈0．05）。通过以上指标的测定,我们认为所建立的动物模符合SSH的实验要求。结论建立的旋毛虫抗实体瘤动物模型,可用于旋毛虫抗肿瘤差异基因筛选的实验起始材料,为进一步研究旋毛虫抗肿瘤分子机制创造条件。     

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。     

催乳素受体基因与羊驼繁殖性能关系的初探

通过氯仿/异戊醇法制备羊驼血液基因组DNA,采用PCR方法首次扩增出羊驼催乳素受体基因(prolactin receptor gene,PRLR)exon8-exon9序列(GenBank登录号为DQ198164),该片段长度为622bp。通过NCBI blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比较,结果表明:该序列包括exon8的82bp、intron8全序列472bp和exon9的68bp。同源性比较发现,羊驼PRLR基因exon8和exon9核苷酸序列与其它哺乳动物的相应区域的同源性特高,均≥92%;同时还发现羊驼exon8引物后第19个碱基为G,而其它哺乳动物(猪除外)均为A,猪则是在羊驼exon8引物后的第34个碱基处由G变为A,通过推导氨基酸序列分析发现,这种单碱基的突变使得羊驼与其它哺乳动物相比,该处的氨基酸由亮氨酸取代了异亮氨酸;在羊驼exon9引物前第22个碱基处也发生了A-G碱基替换现象,但这个碱基的突变发生在密码子的第3个碱基上,编码的氨基酸均为脯氨酸。在这些动物中只有羊驼为单胎动物,羊驼exon8核苷酸序列中A-G的碱基替换并引起编码氨基酸序列发生改变是否与羊驼繁殖性能有关还有待进一步研究。     

2种β2-受体激动剂抗血清的比较研究

目的:通过比较分析,为β2-受体激动剂的快速免疫学检测方法及最佳免疫抗血清的选择提供依据。方法:分别以偶氮化法和碳二亚胺法将β2-受体激动剂克伦特罗(CL)和沙丁胺醇(Sal)连接到牛血清白蛋白和卵清蛋白上,免疫家兔;4次免疫后,采血制备抗CL和抗Sal的抗血清;用间接ELISA检测抗血清效价,用间接抑制ELISA检测抗血清交叉反应。结果:为抗CL抗血清的效价为1∶2560,抗Sal抗血清的效价为1∶5120。抗CL抗血清对Sal有0.088%的交叉反应,而抗Sal抗血清对CL有200%的交叉反应;就对CL的抑制而言,抗Sal血清比抗CL血清更敏感。结论:在检测β2-受体激动剂CL时,Sal完全抗原可能是制备抗血清的最佳抗原。     

乳酸菌素Gassericin T基因的人工合成及其组成型表达载体的构建

目的:为了研究乳酸菌素Gassericin T的作用机制及应用价值,人工合成Gassericin T基因并构建能高效表达外源蛋白的毕赤酵母组成型表达载体。方法:应用PCR方法从毕赤酵母染色体中扩增GAP启动子,经测序正确后与已线性化的不含pAOX1启动子的毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9K连接,转化大肠杆菌DH5α。根据Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA的密码子转换成毕赤酵母偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,人工合成gatA片段(简称gat基因),经测序正确后插入pGAP9K质粒的多克隆位点。结果:用GAP启动子(pGAP)取代了pPIC9K上的pAOX1,构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAP9K;PCR拼接获得250bp的目的基因序列,将目的基因克隆于pGAP9K,获得组成型表达载体pGAP9K-gat。结论:为下一步在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白,研究其作用机理和遗传机制奠定了基础。     

核酸适配体及其在病原微生物学中的应用

核酸适配体指利用指数富集配体系统进化技术筛选出的寡聚核苷酸片段,它可以特异性地识别靶标并与之结合,已经广泛应用于基础研究、临床诊断、纳米技术等。以下综述了适配体在微生物学方面的应用。     

水貂GH基因SNP_S与皮张长度的相关性研究

以水貂生长激素(GH)基因作为控制水貂皮张长度性状主基因的候选基因,以大兴安岭水貂养殖基地养殖的水貂群为试验材料,通过PCR-SSCP方法对GH基因进行多态性检测。在该基因内含子1中发现1处碱基突变:C→A,并检测到3种基因型(AA、AB、BB),BB基因型个体与AA基因型个体皮张长度有一定的差异(P0.05)。在外显子2中发现2处碱基突变:T→A、C→G,并由此检测到了3种基因型,分别命名CC、CD、DD,但3种基因型对水貂皮长的影响没有显著的差异(P0.05)。统计各基因型之间的组合给水貂皮长带来的影响时,发现多数组合基因型对所检测的水貂皮长有显著影响(P0.05)。     

动物细胞大规模培养技术

近年来,动物细胞大规模培养技术在生物技术领域成为最受关注的热点之一,并开始广泛应用于生物医药的研发和生产过程中。以生物反应器技术为基础的动物细胞大规模培养技术平台,正逐步被建立起来并日益走向成熟,成为推动生物医药产业快速发展的有力工具。结合该技术目前的应用水平和最新进展,分析了不同细胞培养工艺之间的内在差异,以探索这一技术的未来发展方向。